客户文章 | 应用DAP-seq技术鉴定百脉根中一个NAC转录因子在全基因上的靶基因，揭示硝酸盐诱导根瘤衰老的新机制

豆科植物通过与根瘤菌共生，形成能够固氮的根瘤。硝酸盐能够影响根瘤共生的过程，适宜浓度的硝酸盐促进结瘤固氮，而高浓度的硝酸盐抑制菌根共生，并且会促进根瘤衰老。NLP (NIN-Like Protein)转录因子调控硝酸盐信号转导，百脉根NLP1与NLP4的缺失，能够有效缓解高浓度硝酸盐对菌根共生和固氮的抑制作用。然而，NLP调控根瘤固氮与根瘤衰老的分子机制需要进一步研究。

2023年3月22日，华中农业大学端木德强课题组的最新研究成果，发表在New Phytologist期刊上(影响因子10.323)，文章题目为“A transcription factor of the NAC family regulates nitrate-induced legume nodule senescence”。该研究使用DNA亲和纯化测序(DAP-seq)技术鉴定了豆科模式植物百脉根中一个NAC转录因子的结合基序和靶基因，揭示了NAC094在硝酸盐诱导的根瘤衰老过程中发挥重要的调控作用，为培育具备高效氮利用特性的农作物新品种奠定了重要基础。

本研究采用高浓度硝酸盐处理百脉根，对根瘤样品进行转录组测序分析，与已有的两个根瘤早衰突变体转录组数据进行联合分析，鉴定到一个转录因子Lj2g3v1058050，该基因受硝酸盐诱导上调表达，并且在早衰根瘤突变体中显著上调表达。该基因编码一个NAC转录因子，与拟南芥ANAC094同源，将其命名为LjNAC094。

图1. NAC094的鉴定与表达模式分析

对NAC094的过表达株系（NAC094-OE）进行表型分析，发现过表达NAC094显著促进了根瘤衰老。过表达株系的转录组数据显示，NAC094调控的基因与硝酸盐响应基因具有高度一致性。

图2. NAC094过表达导致根瘤早衰表型

通过DAP-seq技术鉴定了NAC094在全基因组上的调控靶基因。利用EMSA以及转录激活实验对衰老相关基因(SAGs)进行互作验证。溶菌酶(LYS)与半胱氨酸蛋白酶(CYPs)参与了根瘤衰老过程中蛋白质的降解和细胞裂解过程。铜转运蛋白(COPT)和肽转运蛋白(PTR)参与了根瘤衰老过程中营养物质的回收利用。

图3. DAP-seq鉴定NAC094调控的靶基因

NAC094的缺失能够缓解硝酸盐诱导的豆血红蛋白的降解，同时阻断了根瘤中由硝酸盐诱导的衰老相关基因的上调表达。这说明NAC094对于衰老相关基因的表达至关重要。对nlp1、nlp4和nlpl nlp4突变体根瘤进行硝酸盐处理，发现NLP1/NLP4的缺失，抑制了硝酸盐诱导的NAC094及其靶基因的表达。这说明NAC094位于NLP1和NLP4的下游。

代谢组学结果显示，在硝酸盐处理后的野生型根瘤中，多种二肽和核苷酸分子水平升高，而在nac094突变体根瘤中没有显著变化。一些磷脂分子在处理后的野生型根瘤中的含量显著降低，而在nac094突变体根瘤中变化并不明显。与转录组数据联合分析发现，编码蛋白酶、肽酶、核酸酶以及磷脂酶的相关基因受硝酸盐诱导表达上调，并在过表达NAC094的根瘤中显著上调表达，这些基因可能参与了根瘤衰老过程中的蛋白、多肽、核酸与磷脂的代谢过程。

图4. NAC094参与硝酸盐诱导根瘤衰老的工作机制模型

综上所述，在硝酸盐诱导的根瘤衰老过程中，NAC094正调控根瘤衰老，位于NLP1/NLP4的下游，通过激活衰老相关基因参与调控硝酸盐诱导的根瘤衰老过程。这些衰老相关基因参与细胞裂解、蛋白与核酸水解。该研究利用多组学数据，阐明了根瘤衰老的信号转导和物质代谢途径。

论文链接：https://doi.org/10.1111/nph.18896