客户文章 | DAP-seq助力揭示YABBY11转录因子调控杨树叶形自然变异的分子机制

2023年3月，北京林业大学生物学院宋跃朋教授课题组的研究成果发表在了Plant Physiology期刊上（影响因子7.4），文章题目为 “Enhanced genome-wide association reveals the role of YABBY11-NGATHA-LIKE1 in leaf serration development of Populus”的研究论文。该研究使用DNA亲和纯化测序(DAP-seq)技术鉴定了杨属YABBY11转录因子的结合基序和靶基因。发现YABBY11与杨树叶形自然变异显著关联，为探索理想叶形遗传改良奠定了理论基础。

该研究发现，在毛白杨基因组中，YABBY11由于存在提前终止位点（PtoYAB11^PSC），从而导致锌指结构域缺失，进而失去了对下游靶基因PtoNGAL-1与PtoRBCL的转录激活作用，使叶缘锯齿加剧、叶面积增大、光合利用效率提升。

图 1 杨树自然群体叶形变异显著

杨树叶片形态变异丰富，在种间与种内都存在显著的自然变异。为了阐明杨树叶片形态自然变异的遗传学基础，以毛白杨与小叶杨种质资源群体为材料，发现在两个关联群体中，基因型-表型关联显著性最高的SNPs均位于YABBY11基因上。在毛白杨群体中，YABBY11具有提前终止位点（PtoYABBY11^PSC），导致与DNA结合的锌指结构域完全丢失，仅保留了核定位信号。以YABBY11为候选基因构建系统发育树，显示提前终止位点仅存在白杨派中，暗示了YABBY11^PSC可能是一个白杨派特异的基因变体。

图 2 基于持续同调拓扑数据高通量量化的全基因组关联分析

图3 杨属YABBY11基因系统发育树

为阐明PtoYABBY11^PSC携带的提前翻译终止位点是否改变了YABBY11下游的转录调控网络，研究者利用表达数量性状位点定位策略（eQTNs）分别对毛白杨和小叶杨群体YABBY11核酸变异与表达量进行分析。在毛白杨群体中，97个SNPs与55个基因表达量显著关联。在小叶杨群体中，共发现61个SNPs与52个基因形成表达量显著关联。靶基因功能注释结果显示，PtoYABBY11^PSC与PsiYABBY11下游转录调控网络基因显著不同，暗示PtoYABBY11^PSC携带的提前翻译终止位点已经显著改变了毛白杨YABBY11下游的转录调控网络。

图 4 PsiYABBY11基因通过顺式作用元件与下游靶基因相互作用

使用DAP-seq技术，对具有完整转录因子结构的PsiYABBY11下游靶基因进行筛选，在164个基因上共筛选到220个PsiYABBY11互作位点，其中37.5%的互作位点位于转录起始位点上游2000 bp范围内。对PsiYABBY11下游靶基因进行KEGG通路注释，PsiYABBY11的下游靶基因主要富集在photosynthesis, oxidative phosphorylation, starch and sucrose metabolism, 以及 ribosome等通路中。联合eQTNs与DAP-seq分析结果，共筛选出NGAL1, RBCL, PHOTOSYSTEM II REACTION CENTER PROTEIN B (PSBB), ATP SYNTHASE SUBUNIT ALPHA (ATPA)以及ATP SYNTHASE EPSILON CHAIN (ATPE) 基因为PsiYABBY11的下游靶基因。酵母单杂交与EMSA实验进一步验证了PsiYABBY11可以和NGAL1 与RBCL基因的启动子直接结合。双荧光素酶实验结果表明PsiYABBY11能够激活NGAL1 与RBCL基因表达。酵母单杂实验结果进一步证明了NGAL1与其下游生长素响应靶基因CUC2也存在相互作用。该结果表明，YABBY11-NGAL1-CUC2 可能通过调控杨树叶边缘发育进而导致叶片形态的自然变异。

图 5 PsiYABBY11与PtoYABBY11^PSC分子功能解析

在PtoYABBY11^PSC与PsiYABBY11的过表达株系中， PtoYABBY11^PSC-OE植株叶长、叶宽、叶面积显著增加，光合作用效率显著提升，叶片边缘锯齿显著加剧。PtoYABBY11^PSC-OE植株叶长、叶宽、叶面积显著减小，光合作用效率降低，叶片边缘光滑，但是叶脉厚度与气孔密度显著增加。 PtoYAB11^PSC-KO的基因敲除突变植株叶片边缘光滑，但是光合作用效率与叶片面积没有显著改变。

图 6 杨属YABBY11调控叶形自然变异的分子机制

以上研究结果表明， YABBY11激活NGAL1的表达，进而抑制CUC2基因表达，调控光滑叶缘的形态发育。同时，YABBY11 激活RBCL基因表达，导致Rubisco大小亚基装配失调，进而光合作用效率下降。而在白杨派树种中，YABBY11^PSC由于携带翻译提前终止位点，丧失了对NGAL1-CUC2模块以及RBCL基因的转录调控作用，进而导致叶片面积增大、叶片锯齿加剧、光合作用效率提升。此外，YABBY11在毛白杨与小叶杨中均对胁迫信号响应敏感，暗示了YABBY11-NGAL1-CUC2可能是基因组与环境信号互作调控叶形变异的关键分子调控模块。该模块为系统了解叶形响应外界环境信号产生自然变异提供了一个全新的视角，为探索理想叶形遗传改良奠定了理论基础。

原文链接：https://doi.org/10.1093/plphys/kiac585