J Integr Plant Biol（IF=9.3）|DAP-seq助力揭示多年生黑麦草LpMYBR1调控叶色的分子机制

文献题目：LpMPK6 regulates leaf color in perennial ryegrass by inhibiting LpMYBR1-modulated transcription of LpNRT1.5

发表期刊：Journal of Integrative Plant Biology

影响因子：9.3

发表时间：2026年3月12日

发表单位：西北农林科技大学

蓝景科信提供：DAP-seq技术服务

主要研究内容

草坪草叶色是评判其观赏价值与生长健康状态的核心指标，氮素是构成叶绿素的关键元素，硝态氮的吸收、转运过程显著影响草坪草叶色表型，而多年生黑麦草中氮素介导叶色调控的分子机制一直未被阐明。本研究发现，低氮/缺营养条件下，LpMPK6过表达株系叶片黄化加剧，叶绿素、总氮及硝态氮含量降低，RNAi株系则保持绿叶、氮素与叶绿素含量更高，证明LpMPK6负调控黑麦草叶色与氮积累。经酵母双杂交、Pull-down、Co-IP、荧光素酶互补等实验证实，LpMPK6与转录因子LpMYBR1特异性互作，且二者功能拮抗，LpMYBR1能够改善植株在低氮环境下的叶片持绿特性。

为挖掘LpMYBR1的下游靶基因，本研究借助DAP-seq技术开展全基因组筛选，共鉴定出90001个LpMYBR1结合峰，其中8.2%位于基因启动子区域；同时预测得到6个MYB转录因子保守结合基序。对启动子区对应的靶基因进行GO功能富集分析，显著富集到6个氮素调控相关通路，并筛选出LpNRT1.5、LpNRT1.8等硝态氮转运蛋白候选基因。酵母单杂交、凝胶迁移及双荧光素酶实验证实，LpMYBR1能够直接结合LpNRT1.5启动子并激活其转录，但对LpNRT1.8无调控作用。功能验证表明，定位于细胞膜的LpNRT1.5特异性介导硝态氮从根系向地上部转运，并不参与根系对硝态氮的吸收。磷酸化实验进一步证明，LpMPK6可靶向磷酸化LpMYBR1的第18位苏氨酸残基，显著削弱LpMYBR1的转录激活活性；该调控效应会抑制LpNRT1.5表达，降低硝态氮根冠转运效率，最终导致叶片氮素与叶绿素合成受阻，引发叶片黄化。

该研究解析了多年生黑麦草中LpMPK6-LpMYBR1-LpNRT1.5的调控通路，完善了叶色与氮素代谢的分子机理研究，对培育低氮适应性强、观赏品质优良的草坪草品种具有重要指导意义。

图1. LpMPK6与LpMYBR1的相互作用。（A）酵母双杂交（Y2H）实验显示LpMPK6与LpMYBR1之间的相互作用。（B）荧光素酶互补成像（LCI）实验表明LpMPK6与LpMYBR1存在相互作用。（C）下拉实验显示GST-LpMPK6与His-LpMYBR1的结合关系。（D）共免疫沉淀（Co-IP）实验证实植物中LpMYBR1-GFP可与LpMPK6-Flag结合。

图2. LpMYBR1调控LpNRT1.5的转录。（A）通过DAP-seq鉴定出的LpMYBR1结合峰在全基因组范围内的分布。（B）推定LpMYBR1靶基因的GO富集情况。（C、D）野生型、LpMYBR1过表达株及RNAi处理幼苗中15NO3-的吸收效率（C）和根-茎转运效率（D）。（E）野生型、LpMYBR1过表达株及RNAi处理幼苗中LpNRT1.5的转录水平。（F）LpNRT1.5启动子片段示意图。（G）LpMYBR1与截短启动子（pLpNRT1.5T）结合的酵母单杂交实验结果。（H）LpMYBR1与F1/F2启动子片段结合的EMSA实验结果。（I）双荧光素酶实验中使用的效应基因与报告基因构建体示意图。（J）双荧光素酶实验的代表性荧光图像。（K）LUC/REN荧光素酶活性相对值。