如何验证转录因子与靶基因互作？

在生命科学领域，蛋白质与 DNA 的相互作用构成了生命活动的分子基础，精准调控着基因表达、细胞命运决定和遗传信息传递等关键生物学过程。这种精密的分子互作机制不仅维持着生物体的正常生理功能，更为疾病靶向药物研发、作物抗逆遗传改良等前沿方向奠定核心理论支撑。

科研人员常利用 DAP-seq、ChIP-seq、CUT&Tag 等高通量测序批量筛选转录因子的下游候选靶位点，也可通过 DNA Pull-down、酵母单杂交技术反向挖掘靶基因上游的候选转录因子。面对大量初筛得到的候选互作线索，不少科研工作者都会产生相同困惑：怎样才能精准证实转录因子与靶基因序列存在真实结合？

今天我们就来介绍一下常用的验证转录因子与靶基因启动子互作的实验手段。

一、ChIP-qPCR

染色质免疫共沉淀 - 实时荧光定量 PCR（Chromatin immunoprecipitation-qPCR, ChIP-qPCR）是研究体内蛋白与 DNA相互作用的关键技术。相较于各类体外互作实验，该技术依托体内富集体系，能够更真实地反映转录因子与DNA的天然结合状态。其原理是用甲醛交联细胞内蛋白-DNA 复合体，维持天然相互作用状态；随后通过超声或核酸酶处理将染色质裂解为片段化 DNA。接着利用目的蛋白特异性抗体进行免疫沉淀，捕获与目标蛋白结合的 DNA 片段。免疫沉淀后通过解交联释放DNA，经纯化后采用 qPCR 技术对特定 DNA 序列进行定量检测，通过对比 IgG 对照组的 qPCR 信号强度，可判断目标蛋白与特定 DNA 序列的结合情况及相互作用强度。

二、双荧光素酶报告基因实验（Dual-LUC）

双荧光素酶报告实验（Dual-luciferase reporter assay，DLR）是一种在生物学研究中广泛应用的技术，主要用于解析基因表达调控机制，可定量评估转录因子与靶基因启动子的相互作用及启动子活性。

该实验通常使用萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）双报告系统：

萤火虫荧光素酶基因常作为报告基因，与目标基因的启动子序列构建在同一载体上，其表达直接受目标启动子调控。

海肾荧光素酶基因作为内参基因，由组成型启动子驱动，在细胞内稳定表达。

当细胞同时转染含有这两种基因的载体后，加入相应的荧光素底物，两种荧光素酶会催化底物发光。通过检测两种荧光信号的强度比值（Luc/Ren），可归一化处理实验数据，消除细胞转染效率、细胞活性等因素对实验结果的影响，从而准确反映目标启动子的活性。

三、凝胶迁移实验（EMSA）

凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay, EMSA）是一种能够在体外直观展示蛋白质与 DNA 在体外相互作用的技术。其原理是基于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在电场作用下，DNA 分子会依据自身大小和电荷在凝胶中发生迁移。当蛋白质与 DNA 特异性结合时，所形成的复合物分子量增加，电荷分布也会改变，进而导致迁移速率降低。在凝胶成像结果中，未结合蛋白质的 DNA 条带迁移距离较长，位置靠前；而结合了蛋白质的 DNA 条带迁移距离较短，位置靠后，此即 “滞后条带”。通过对比添加蛋白质前后 DNA 条带的迁移情况，即可判断蛋白质与 DNA 之间是否存在相互作用。

四、酵母单杂交 （Y1H）

酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid, Y1H）是解析细胞内 DNA-蛋白质相互作用的经典分子生物学工具。其核心原理基于真核生物转录激活子的结构特征，这类转录激活子通常包含 独立发挥功能 的 DNA 结合结构域（DNA Binding Domain, BD） 和 转录激活结构域（Transcription Activation Domain, AD）。

构建酵母单杂交体系时，将含有特定顺式作用元件的 “诱饵” DNA 序列整合进酵母基因组，使其与报告基因相连。同时，将潜在结合的转录因子（“猎物”）和转录激活结构域 AD 构建成融合表达载体，导入酵母细胞。若转录因子能特异性结合 “诱饵” DNA，AD 会招募转录复合物，启动报告基因表达。通过检测报告基因的表达水平，即可判断转录因子与 DNA 是否存在相互作用。

选择指南

以上四种技术是目前比较常用的转录因子与靶基因启动子互作验证手段。它们各有侧重，在实际应用中，一般会选择2种及以上技术手段进行验证，同时兼顾体内实验和体外实验。

案例解析

案例一：CsYABBY3-CsAS1正反馈回路协同调控大麻腺毛分化与大麻素合成

文献题目：A Novel CsYABBY3-CsAS1 Feedback Loop Coordinates Trichome Differentiation and Cannabinoid Biosynthesis in Cannabis sativa L.

发表期刊：Advanced Science

影响因子：14.1

技术应用：DAP-seq、Y1H、Dual-LUC

研究内容：

大麻腺毛是大麻素生物合成与储存的“微工厂”，但其分化与代谢积累如何协同调控尚不清楚。研究团队通过多品种、多组织转录组筛选，鉴定到大麻腺毛特异性高表达的转录因子CsYABBY3。功能验证表明，CsYABBY3既能促进腺毛分化，又能显著提升CBD、CBG等主要大麻素含量。DAP-seq全基因组结合分析共鉴定3154个结合峰，其中12.4%位于启动子区，核心基序为TAATTAA，靶基因显著富集于萜类合成通路。Y1H与Dual-LUC实验证实CsYABBY3直接结合并激活关键基因CsPT4和CsCBDAS启动子。此外，转录因子CsAS1亦可独立激活大麻素合成，且与CsYABBY3通过物理互作形成转录复合体，协同增强下游基因表达。本研究揭示了一条正反馈转录调控回路，实现了腺毛分化与代谢合成的精准偶联，为大麻素高效代谢工程提供了重要靶点。

案例二：LpMPK6-LpMYBR1-LpNRT1.5调控通路介导硝态氮转运与叶色维持

文献题目：LpMPK6 regulates leaf color in perennial ryegrass by inhibiting LpMYBR1-modulated transcription of LpNRT1.5

发表期刊：Journal of Integrative Plant Biology

影响因子：12.5

技术应用: DAP-seq、Y1H、EMSA、Dual-LUC

研究内容：

多年生黑麦草叶色是衡量其观赏价值与氮素营养状态的核心指标，但硝态氮转运调控叶色的分子机制尚不清楚。研究发现，LpMPK6负调控叶色与氮积累，而转录因子LpMYBR1功能与之拮抗，可改善低氮下的叶片持绿性。为挖掘LpMYBR1下游靶基因，研究采用DAP-seq技术共鉴定90001个结合峰，富集到多个氮素调控通路，并筛选出硝态氮转运蛋白基因LpNRT1.5。Y1H、EMSA和Dual-LUC实验验证了LpMYBR1直接结合并激活LpNRT1.5启动子。进一步研究表明，LpMPK6通过磷酸化LpMYBR1的第18位苏氨酸残基削弱其转录激活活性，抑制LpNRT1.5表达，降低硝态氮根冠转运效率，最终导致叶片黄化。该研究系统解析了LpMPK6-LpMYBR1-LpNRT1.5调控通路，为低氮适应型草坪草育种提供了理论依据。

案例三：GbDEAH12^G-GbNAC072^C-GbHOX3模块调控海岛棉衣分与纤维起始

文献题目：Relief of GbDEAH12^G repression on the GbNAC072^C-GbHOX3 axis improves lint percentage in Gossypium barbadense

发表期刊：Nature Communications

影响因子：18.1

技术应用：DAP-seq、RNA-seq、Y1H、EMSA、Dual-LUC、ChIP-qPCR

研究内容：

海岛棉纤维品质优异但衣分偏低，其分子调控机制尚不清晰。研究团队基于群体重测序与变异鉴定，锁定衣分关联候选基因GbNAC072与GbDEAH12。功能验证表明，GbNAC072^C为正向调控衣分的优良等位变异，可促进胚珠表皮细胞凸起与纤维起始；GbDEAH12^G则抑制纤维发育，二者功能分化显著。为解析GbNAC072^C调控网络，研究采用DAP-seq技术共鉴定149380个结合峰，其中12.0%位于启动子区，核心基序为CACG，靶基因富集于表皮毛分化等纤维发育通路。联合RNA-seq筛选出下游关键靶基因GbHOX3，经Y1H、DLR、ChIP-qPCR及EMSA证实GbNAC072^C直接结合并激活GbHOX3启动子，而等位变异GbNAC072^T无此功能。进一步发现GbDEAH12^G可抑制GbNAC072^C，GbDEAH12^C无抑制活性，双基因组合中GbDEAH12^C-GbNAC072^C为优良组合，可显著提升衣分。群体分析表明该模块决定海岛棉衣分表型变异。本研究揭示了GbDEAH12^G-GbNAC072^C-GbHOX3分子模块调控海岛棉衣分的新机制，为高产分子育种提供了关键基因资源。

蓝景科信核心服务体系涵盖DAP-seq、RNA-seq及ChIP-seq、ATAC-seq等组学技术，同时配套EMSA、Dual-LUC、Y1H、ChIP-qPCR等下游验证方案，并提供蛋白Pull-down、Y2H、Co-IP等全套蛋白互作服务。打造“组学检测—功能验证—互作分析”一站式转录因子研究解决方案，全方位支撑科研工作高效推进！