Plant Cell Environment（IF=6.3）▏DAP-seq技术助力揭示三叶草TaUPL21调控根系发育的分子机制

文献题目：A HECT‐Type E3 Ubiquitin Ligase TaUPL21 Promotes Root Development in Caucasian Clover by Directly Activating Transcription of TaAGL29

发表期刊：Plant Cell Environment

影响因子：6.3

物种：三叶草

发表单位：东北农业大学

发表时间：2026年3月1日

蓝景科信提供：DAP-seq技术服务

主要研究结果

高加索三叶草是多年生优质豆科牧草，根系发达、耐寒耐旱、水土保持能力突出，是饲草生产与生态修复的优势种质资源。HECT型E3泛素连接酶（UPL）是植物生长发育的核心调控因子，但传统研究仅聚焦其泛素化降解功能，该类蛋白在牧草根系发育中的调控机制长期未被解析。

研究团队从高加索三叶草中鉴定出32个TaUPL基因，其中TaUPL21在根茎芽中特异性高表达，成为调控根系生长的核心候选基因。功能验证显示，过表达TaUPL21可显著提升根长、根体积、根尖数与根表面积，直接证实其正向驱动根系发育的关键作用。通过DAP-seq全基因组鉴定TaUPL21结合位点，两个生物学重复分别鉴定出1607和1066个结合峰，其中11.2%的峰位精准定位在基因启动子区域；GO与KEGG富集显示其靶基因参与次生代谢、基因组稳定、表观调控、胁迫响应与发育调控等多种过程。进一步Y1H、Dual-Luc等证实TaUPL21可直接结合TaAGL29启动子并发挥转录激活作用，显著上调其表达水平。过表达TaAGL29同样显著促进根长、鲜重增加与生根能力提升，与TaUPL21表型高度一致。综上表明，TaUPL21–TaAGL29通路是调控高加索三叶草根系发育的关键分子模块。

该研究揭示了植物HECT型E3泛素连接酶兼具泛素连接酶与转录激活子双重功能，突破了植物E3泛素连接酶的传统功能认知，为豆科牧草根系结构改良、抗逆性提升与高产育种提供了全新基因资源与理论支撑，对推动优质饲草育种创新、助力生态修复与畜牧业高质量发展具有重要应用价值。

图1. 大豆与高加索三叶草TaUPL基因家族的最大似然（ML）系统发育树及该家族在三叶草不同根部位的表达水平。（A）基于全长序列、经1000次自展检验构建的大豆与高加索三叶草TaUPL基因家族最大似然（ML）系统发育树。（B）TaUPL家族在三叶草不同根部位的表达水平。

图2. TaUPLs的系统发育关系、保守基序与基因结构域。（A）基于全长序列、经1000次自展检验构建的TaUPL蛋白最大似然（ML）系统发育树。（B）TaUPLs的结构域分布。（C）TaUPL蛋白中保守基序的分布。

图3. TaUPL21的最大似然（ML）系统发育树、氨基酸多序列比对、蛋白表达结果、三维结构与疏水性分析。（A）基于全长序列、经400次自展检验构建的TaUPL21最大似然（ML）系统发育树。（B）TaUPL21的氨基酸多序列比对。（C）蛋白表达结果。（D）TaUPL21蛋白的三维结构。（E）疏水性分析。

图4. 高加索三叶草TaUPL21过表达毛状根表型及相关指标。（A–D）高加索三叶草中过表达TaUPL21的毛状根。（E）过表达TaUPL21的根体积。（F）过表达TaUPL21的根分叉数。（G）过表达TaUPL21的根长。（H）过表达TaUPL21的根尖数。（I）过表达TaUPL21的根表面积。

图5. TaUPL21DNA结合活性的DAPseq分析与功能验证。（A）TaUPL21DAPseq实验两个技术重复间峰的一致性分析。（B）TaUPL21结合峰在各功能区域（如启动子、外显子、内含子）的基因组注释统计。（C）从TaUPL21识别区间富集得到的保守基序。（D）所有TaUPL21靶基因的结合位点中心到转录起始位点（TSS）的距离分布。

图6. TaUPL21直接结合并正向调控TaAGL29。（A）TaAGL29启动子序列及重要顺式作用元件分布。（B）TaUPL21与TaAGL29启动子的结合位点。（C）酵母单杂交实验验证TaUPL21结合TaAGL29启动子。（D）瞬时表达实验所用效应子与报告子载体示意图。（E）TaUPL21与TaAGL29启动子的瞬时表达转录调控实验。（F）转化杨树原生质体12小时后检测的LUC/REN相对荧光素酶活性。

图7. 高加索三叶草TaAGL29过表达毛状根表型、根长与根鲜重。（A）高加索三叶草中过表达TaAGL29的毛状根。（B）过表达TaAGL29的根长。（C）过表达TaAGL29的根鲜重。

图8. TaUPL21–TaAGL29通路促进高加索三叶草根系发育。

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