生物大分子互作技术——Pull-down详解

分子互作是生命活动的基础，不同生物分子之间的识别、结合与调控，贯穿于基因表达、信号传导、细胞命运决定等几乎所有生命过程。生物分子间的相互作用（蛋白-DNA、蛋白-RNA、蛋白-蛋白）是生命科学研究的核心内容，也是揭示基因调控、蛋白功能及疾病机制的关键。Pull-down实验（又称拉下实验）既能用于筛选未知互作分子，也可用于验证已知分子间相互作用。根据研究对象的不同，主要分为蛋白Pull-down、DNA Pull-down和RNA Pull-down三大类。

一、蛋白Pull-down

1.1 技术简介

蛋白Pull-down是研究蛋白-蛋白相互作用的经典体外实验技术。常用标签：GST、His、Halo等，其中Halo标签因共价结合、稳定性高、非特异性背景低的优势，广泛应用于真核蛋白互作研究。

1.2 技术原理

蛋白Pull-down的原理是将已知的“诱饵蛋白”与亲和标签融合表达，利用该标签与固相基质（如琼脂糖树脂或磁珠）上配体的特异性结合，将诱饵蛋白固定在基质上；再与含有潜在“猎物蛋白”的样品（如细胞裂解液）孵育，使诱饵蛋白捕获互作蛋白；经洗涤去除未结合的杂蛋白，洗脱获得互作复合物，最终通过Western blot、质谱等方法鉴定猎物蛋白。

图1 蛋白Pull-down流程图

1.3 技术优势

l 无需针对靶蛋白的特异性抗体，直接验证体外蛋白互作；

l Halo Tag标签与磁珠共价结合，显著降低非特异性结合背景。

1.4 常用标签及表达系统

二、DNA Pull-down

2.1 技术简介

DNA Pull-down是研究DNA-蛋白质相互作用的体外实验技术，主要用于转录调控机制研究。该技术以特定DNA序列为探针，从细胞核蛋白中筛选并鉴定能够与DNA结合的蛋白，如转录因子、转录调控蛋白等。

2.2 技术原理

DNA Pull-Down使用生物素标记的DNA探针作为诱饵，与提取的内源细胞核蛋白进行孵育，捕获与DNA探针特异性结合的蛋白（比如转录因子），最终使用蛋白质谱的方法，鉴定出特异性结合的蛋白。

图2 DNA Pull-down流程图

2.3 技术优势

l 可富集低丰度DNA结合蛋白。

l DNA探针制备简便，无需构建复杂文库，直接体外验证结合。

三、RNA Pull-down

3.1 技术简介

RNA在基因表达调控中发挥重要作用，非编码RNA（lncRNA、circRNA、miRNA）是当前研究热点。RNA与蛋白的相互作用是非编码RNA发挥功能的核心机制。RNA Pull-down是检测RNA-蛋白互作的核心体外技术，主要用于筛选与验证RNA结合蛋白（RBPs）。

3.2 技术原理

RNA Pull-Down根据目标 RNA 序列设计特异性 DNA 模板，通过体外转录制备生物素标记 RNA 探针；先将标记探针与链霉亲和素磁珠偶联，制备固定有 RNA 探针的磁珠复合物，再与细胞蛋白提取液共孵育，捕获能与 RNA 探针特异性结合的蛋白并形成 RNA-蛋白质复合物。经洗涤去除非特异性结合蛋白、完成富集后，对富集蛋白进行LC‑MS/MS 质谱分析，即可鉴定出与目标 RNA 特异性互作的蛋白质。

图3 RNA Pull-down流程图

3.3 技术优势

l 灵敏度高，可富集低丰度RNA结合蛋白。

l 可直接筛选与目标RNA结合的蛋白。

四、三种Pull-down实验应用场景

五、常见问题解答

Q1：我的研究部位可以跟实验所用部位不一致吗？

建议使用与研究目标一致的组织样本，以保证结果可靠性。

Q2:我需要提供哪些材料？

DNA Pull-down与RNA Pull-down需要提供探针序列/模板及组织等材料。

蛋白Pull-down需要提供蛋白CDS序列/质粒模板及组织等材料。

Q3：结果交付结果包含哪些信息？

质谱原始数据，实验原图，质谱差异分析及富集分析等全套数据。

Q4：强结合蛋白更容易鉴定到吗？

不一定，结果受蛋白丰度、洗涤条件、质谱灵敏度影响。建议筛选后针对性验证。

Q5：蛋白Pull-down和Co-IP的区别？

蛋白Pull-down不依赖靶蛋白特异性抗体，体外验证蛋白直接相互作用；Co-IP依赖靶蛋白特异性抗体，在细胞生理内源环境下验证蛋白直接或间接相互作用。

蛋白、DNA、RNA三大Pull-down快速选择：

✅ 看蛋白互作→蛋白Pull-down

✅ 看转录调控→DNA Pull-down

✅ 做非编码RNA/RNA结合蛋白→RNA Pull-down